注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實驗過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
酸甲酯(色譜級)Nav1.5 (D9J7S) Rabbit mAb羧基噠

二甲酸酯(色譜級)Zap-70 (D1C10E) XP® Rabbit mAb (PE Conjuga)基噻吩

異戊烷(色譜級)c-Myc (D84C12) Rabbit mAb (Pacific Blue™ Conjuga)氨基-5-甲基吡啶

甲(色譜級)Ras (G12D Mutant Specific) (D8H7) Rabbit mAb正丁基

對甲酰(色譜級)SF3B1 (D7L5T) Rabbit mAb2-脫氧-2,2-二氟戊呋喃糖-1-酮 3,5-二安息香酸鹽

硝烷(色譜級)CART (D6M2M) Rabbit mAb四(3,5-二叔丁基-羥基)酸季戊四酯

正辛烷(色譜級)LEF1 (C12A5) Rabbit mAb (PE Conjuga)1-環(huán)基哌

2-戊酮(色譜級)p38 MAPK (D13E1) XP® Rabbit mAb (HRP Conjuga)6-甲基-2-基吡啶

戊酮(色譜級)EpCAM (D9S3P) Rabbit mAb (IHC Preferred)2,二氟三氟甲

正(色譜級)TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (PE Conjuga)5-氟-2-甲

正戊烷(色譜級)ELMO1 (D4K2E) Rabbit mAb5--2-甲酸

石油(色譜級)Phospho-PLCγ1 (Tyr783) (D6M9S) Rabbit mAb (PE Conjuga)2-溴-6-甲氧基甲酸

石油(色譜級)MPC1 (D2L9I) Rabbit mAbD-亮氨

石油(色譜級)BiP (C50B12) Rabbit mAb (PE Conjuga)2，二溴

三(色譜級)RAP80 (D1T6Q) Rabbit mAb5-甲氧基-2-

叔丁(色譜級)S6 Ribosomal Proin (5G10) Rabbit mAb (HRP Conjuga)硝地平

異辛烷(色譜級)ELL (D7N6U) Rabbit mAb2-喹噁啉

異辛烷(色譜級)E-Cadherin (4A2) Mouse mAb2-[(羥基氨基)亞氨基]-1-吡咯烷甲酸叔丁酯

第八因子相關(guān)抗原(FⅧAg)ELISA試劑盒HLA G  類白細(xì)胞抗原G20 ul

第10號染色體缺失并與張力蛋白同源的酸酶(PN/MMAC1)ELISA試劑盒HLA E  類白細(xì)胞抗原E100 ul

抵抗素樣分子β(RELM-β)ELISA試劑盒HMGA1  高遷移率族蛋白A1100 ul

抵抗素(Resistin)ELISA試劑盒HMGA2  高遷移率族蛋白A2100 ul

低氧誘導(dǎo)因子3α(HIF-3α)ELISA試劑盒HMGB1  高遷移率族蛋白B1100 ul

低氧誘導(dǎo)因子2(HIF-2)ELISA試劑盒HMGB4  高遷移率族蛋白B4100 ul

低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)ELISA試劑盒HNF1/LFB1/HNF1A  肝細(xì)胞核因子1α100 ul

低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(LRP-5)ELISA試劑盒Heme Oxygenase 1/HO-1  血紅素氧合酶 1/熱休克蛋白32100 ul

低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4(LRP-4)(IgG)ELISA試劑盒Heme Oxygenase 1/HO-1  血紅素氧合酶 1/熱休克蛋白32100 ul
人Cosmc基因PCR檢測試劑盒廠家EFHC1蛋白抗體N-Benzylcinchonidinium chloride中文名：N-芐基氯化辛可寧丁別名：分子式：C26H29ClN2O

EFHC2蛋白抗體4,4'-Biphenyldicarboxylic acid中文名：4,4'-聯(lián)苯二甲酸別名：分子式：C14H10O4

EFHD1蛋白抗體9,9-Bis(4-ami-3-methylphenyl)fluorene中文名：9,9-雙(4-氨基-3-甲苯基)芴別名：分子式：C27H24N2

突觸結(jié)合蛋白2抗體4-Benzoyl-3-methyl-1-phenyl-5-pyrazolone中文名：4-苯甲酰基-3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮別名：分子式：C17H14N2O2

表皮生長因子受體5抗體5-Benzyloxyindole中文名：5-芐氧基吲哚別名：分子式：C15H13
檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設(shè)置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。