注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
?
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
2-Amithiazole乙二甲 CP鄰苯二甲酸酐 AR

Benzimidazole乙二甲 AR鄰苯二甲酸酐 CP

Butyl-PBD乙二甲  >99.5%(GC)鄰苯二甲酸酐 ACS

Indazole乙二甲 ACS氫氧化鈉 AR,96%

MBT乙二甲 分析標(biāo)準(zhǔn)品，>99.9%(GC)氫氧化鈉 CP,95%

Carbazole乙二甲 光譜純,>99.7%(GC)氫氧化鈉 GR,97%,片狀

Urea乙二甲 色譜純,>99.7%(GC)氫氧化鈉 ACS,97%,片狀

Bilirubin(ex pig)乙二甲 用于氨基酸分析,>99.7%(GC)氫氧化鈉 Ph. Eur., BP, NF, E524, 98-100.5%, pellets

Allantoin二乙二二甲  >99.0%(GC)氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液 1.000mol/L (1N)

Quercetin二乙二二甲 ≥99.5% (GC)氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.5000mol/L (0.5N)

Cobalt甲醋酸酯 99%氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2000mol/L (0.2N)

Coblltous carbonate聚乙二二甲 average Mn ~250氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1000mol/L (0.1N)

Cobalt(II,III) oxide乙二  99.4%氫氧化鈉 ≥98%, pellets (anhydrous)

Cobalt(III) oxide三乙二二甲 99%氫氧化鈉 for luminescence, ≥98.0% (T), pellets

Cobaltous acetate tetrahydrate四乙二二甲 99%氫氧化鈉 ACS, K ≤0.02%, ≥98.0% (T), pellets

Cobaltous oxalate dihydrate四乙二二甲 standard for GC ,≥99.5% (GC) 氫氧化鈉 semiconductor grade, 99.99% metals basis

N,N-二甲酰胺-二叔丁縮(>98.0%(N))E2-25K/Hip2 AntibodyKLK2  激肽釋放酶2抗體

N,N-二甲酰胺二甲縮(0.5mL×10)UBE2L3 AntibodyKLK15  激肽釋放酶15抗體

N,N-二甲酰胺二新戊基乙縮(>95.0%(GC))CD3 (17A2) Rat mAb (violetFluor™ 450 Conjugate)KLK14  激肽釋放酶14抗體

N,N-二甲酰胺二甲基縮(>98.0%(GC))MMP-9 AntibodyKLK13  激肽釋放酶13抗體

1-芐基-3-對甲苯基三氮烯(>98.0%(T))COX IV (D6I4K) Rabbit mAb (Rodent Specific)KLK12  激肽釋放酶12抗體

1-甲基-3-對甲苯三氮烯(>98.0%(HPLC)(T))ILK1 (4G9) Rabbit mAbKLK11  激肽釋放酶11抗體

苯基*基氫氧化銨(20-25%的甲溶液)β-Arrestin 2 (C16D9) Rabbit mAbKLK10  激肽釋放酶10抗體

四甲基氫氧化銨(10%的甲溶液)Acetyl-Histone H3 (Lys36) (D9T5Q) Rabbit mAb (PE Conjugate)KLK1  激肽釋放酶1抗體

氫氧化*锍(0.2mol/L的甲溶液)APPL1 (D83H4) XP® Rabbit mAbKLHL9  kelch樣蛋白9抗體

三氯化-甲試劑(5-10%)(1mL×10)APPL1 (D83H4) XP® Rabbit mAbKLHL8  Kelch樣蛋白8抗體
大腸桿菌PCR檢測試劑盒規(guī)格去整合素樣金屬蛋白酶12Tryptophol中文名：別名：分子式：C10H11

磷酸化乙酰輔酶A羧化酶1ACCα抗體5-Hydroxy-2-pyrrolidine中文名：別名：分子式：C4H72

膜粘連蛋白2受體抗體Coixol中文名：薏苡素別名：6-Methoxy-2(3H)-benzoxazolone分子式：C8H73

晚期糖基化終末產(chǎn)物特異性受體抗體Dihydroperaksine中文名：別名：19(S),20(R)-Dihydroperaksine分子式：C19H24N2O2

α2C-AR腎上腺素能受體抗體10-Hydroxydihydroperaksine中文名：別名：10-Hydroxy-19(S),20(R)-dihydroperaksine分子式：C19H24N2O3
檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。