組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

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實驗過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行設(shè)立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設(shè)置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
6-Benzoyl-5,7-dihydroxy-2,2-dimethylchromaneN,N-二仲丁基對苯二胺 96%2-氯吡啶-3-酸 97%

7,8,9-Trimethoxy-10H-1,3-dioxolo[4,5-b]xanthen-10-one壬基酚聚氧乙烯 Type NP-92-氯-3-氟吡啶 98%

7-O-Demethyl-3-isomangostin hydrateDL-氨酸 99%2-氯-5-氟吡啶 98%

7-O-MethylmangiferinN-乙酰-DL-色氨酸 98%2-氯-5-羥基吡啶 97%

8-Benzoyl-5,7-dihydroxy-2,2-dimethylchromaneN-乙酰-3，5-二-L-酪氨酸 98%5-氯-3-羥基吡啶 99%

8-DeoxygartaninD-氨酸甲酯鹽酸鹽 98%3-氯-2-羥基吡啶 98%

9-HydroxycalabaxanthoneN-乙酰-L-亮氨酸 98%4-氯-2-氟苯酸 97%

9-Hydroxycalabaxanthone hydrateN-乙酰-D-亮氨酸 99%5-氯-2-氟苯酸 97%

alpha-MangostinDL-天冬酰胺,一 99%3,4-二肼鹽酸鹽 97%

Beta-mangostinDL-天冬氨酸 98%3,5-二肼鹽酸鹽 98%

BR-Xanthone AL-天門冬氨酸 99%2,4-二肼鹽酸鹽 98%

Butyraxanthone BL-氨酸叔丁酯鹽酸鹽 97%2,5-二肼鹽酸鹽 98%

CotoinN-乙酰-D-氨酸 98%2,4-二氟苯肼鹽酸鹽 98%

Cudraxanthone BL-氨基 98%2,5-二氟苯肼鹽酸鹽 99%

Cudraxanthone DN-乙酰-L-異亮氨酸 98%2,5-二氯苯肼鹽酸鹽 98%

Cudraxanthone LN-乙酰-D-苯氨酸 98%3,5-二氯苯肼鹽酸鹽 95%

3-苯甲酸(>98%,BR)Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit mAbphospho-MAP3K9+MAP3K10(Thr312 + Thr266)  磷酸化絲裂原活化蛋白激酶3K9抗體

3-甲(>98%,BR)ENPP1 (L520) AntibodyPhospho-MAP3K8/Tpl2 (Thr290)  磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶8抗體

3-基磺酸鈉(>98%,BR)Histone Deacetylase 1 (HDAC1) AntibodyPhospho-MAP3K8/Tpl2 (Ser400)  磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶8抗體

3-甲酸(>98%,BR)IQGAP1 (D8K4X) XP® Rabbit mAbphospho-MAP3K7IP1(Thr431)  磷酸化轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶結(jié)合蛋白1抗體

3-苯酸(>98%,BR)IQGAP1 (D8K4X) XP® Rabbit mAbphospho-MAP3K7IP1(Ser423)  磷酸化轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶結(jié)合蛋白1抗體

叔丁基-4-羥基苯甲(>98%,BR)WIF1 AntibodyPhospho-MAP2(Ser136)  磷酸化微管相關(guān)蛋白2抗體

4,4'-聯(lián)吡啶(>98%,BR)Ribosomal Protein L26 AntibodyPhospho-MAP2 (Thr1620/1623)  磷酸化微管相關(guān)蛋白2抗體

4,4-二羥基二苯砜(>98%,BR)MRPL11 (D68F2) XP® Rabbit mAbphospho-MAP1LC3A(Ser12)  磷酸化自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3抗體

4,5-二氯熒光素(>98%,BR)eIF4E (C46H6) Rabbit mAbPhospho-Lyn (Tyr507)  膜相關(guān)蛋白酪氨酸激酶Lyn抗體

4-溴異喹啉(>98%,BR)eIF4E (C46H6) Rabbit mAbPhospho-Lyn (Tyr497)  磷酸化膜相關(guān)蛋白酪氨酸激酶Lyn抗體
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